HPLC: qué es y qué mide en un péptido

HPLC es la cromatografía líquida de alta resolución: una técnica que separa los componentes de una muestra al hacerlos pasar, con un líquido a presión, por una columna. En péptidos se usa sobre todo para medir pureza, como el porcentaje del área del pico principal.

En péptidos se emplea casi siempre la fase inversa (RP-HPLC): una columna con cadenas hidrocarbonadas, como C18, y una mezcla de agua y acetonitrilo cuya proporción cambia durante el análisis. Cada componente sale de la columna en un tiempo distinto, llamado tiempo de retención, y un detector UV, típicamente entre 210 y 220 nm, registra la señal.

El resultado es un cromatograma. La pureza se calcula como el área del pico principal dividida entre el área de todos los picos detectados. Un 99 % significa que el resto de las señales suma 1 % del área a esa longitud de onda, no que la masa del vial sea 99 % péptido: el agua, los contraiones y las sales no siempre aparecen.

HPLC no confirma por sí misma de qué molécula se trata. Un pico limpio puede ser otro péptido con un tiempo de retención parecido. La identidad se comprueba con espectrometría de masas, que mide la masa molecular; por eso un certificado útil reporta las dos.

Qué responde el porcentaje por HPLC y qué no

Al leer un certificado de análisis, el porcentaje por HPLC responde cuánto de lo detectado es el pico principal. La identidad se lee en la masa medida por espectrometría y la cantidad en el contenido declarado: un solo número no responde las tres.

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Fuentes utilizadas

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