Sustancias relacionadas: las impurezas que mide la HPLC
Las sustancias relacionadas son impurezas con una estructura parecida a la del péptido declarado: secuencias a las que les falta un residuo, cadenas truncadas o variantes oxidadas, desamidadas o racemizadas. Se miden por HPLC como porcentaje del área del cromatograma.
Casi todas nacen en la síntesis o en el almacenamiento. Un acoplamiento incompleto en síntesis en fase sólida deja secuencias de deleción; una desprotección incompleta deja grupos protectores pegados; la metionina se oxida a sulfóxido; la asparagina y la glutamina pierden su amida y se desamidan; y un residuo L puede convertirse parcialmente en D.
Como se parecen al péptido, eluyen cerca de su pico principal. Por eso el método cromatográfico tiene que separarlas para que se puedan integrar. La especificación suele fijar un máximo para el total; en los certificados publicados en el sitio es de 2.0 % del área, y la pureza cromatográfica es el complemento de ese total.
Un porcentaje de área sólo cuenta lo que absorbe a la longitud de onda del detector. El agua, el contraión y las sales no aparecen en ese cálculo y se miden con otras pruebas.
Qué indican las sustancias relacionadas sobre un lote
Una pureza de 99 % dice que el 1 % restante del área son impurezas relacionadas. En un ensayo sensible, esa fracción puede tener actividad propia; conocer su total ayuda a decidir si el lote sirve para la pregunta experimental.
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